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喜訊!天昊生物微生物項目文章登陸《Environmental Pollution》

發稿時間:2019-12-26來源:天昊生物


 中國農業科學院蜜蜂研究所吳黎明研究員課題組的研究成果近期發表在環境科學與生態學TOP期刊《Environmental Pollution》上,研究成果發現烯啶蟲胺干擾腸道微生物群,影響代謝穩態和蜜蜂的免疫力,文章第一作者為該課題組博士后朱麗珍。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的相對定量擴增子測序工作。在恭喜客戶發表文章同時,我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

 

英文題目:Nitenpyram disturbs gut microbiota and influences metabolic homeostasis and immunity in honey bee (Apis mellifera L.)

中文題目:烯啶蟲胺干擾蜜蜂腸道微生物群,影響代謝穩態和免疫

期刊名:Environmental Pollution

影響因子: 5.714

研究概要:

近年來,新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的環境風險和毒性引起了人們的廣泛關注。然而,新煙堿類殺蟲劑對腸道微生物的影響相關研究還很有限。在本研究中,將意大利蜜蜂工蜂暴露于亞致死劑量的烯啶蟲胺14天。結果表明,烯啶蟲胺暴露降低了蜜蜂的存活率和攝食量。此外,16S擴增子測序顯示,烯啶蟲胺引起了幾種關鍵腸道微生物群相對豐度的顯著變化,這幾種腸道微生物菌屬在代謝、免疫等方面發揮重要作用。使用RNA-Seq轉錄組測序分析,鑒定到526個差異表達基因(DEGs),其中包括代謝、解毒和免疫等過程的功能基因。此外, GO和KEGG的pathway分析表明,烯啶蟲胺影響了幾種生物過程,其中大部分與代謝有關??傊?,這些研究表明,由烯啶蟲胺引起的蜜蜂腸道微生物群失調可能影響蜜蜂的代謝穩態和免疫功能,進而降低蜜蜂的攝食量和生存率。

研究背景:

蜜蜂是農業上以及世界上的自然生態系統最重要的傳粉者,對人類的糧食供應做出了重大貢獻。作為采集昆蟲,當它們采集花蜜和花粉時,蜜蜂特別容易受到外源毒素的暴露。在已知對蜜蜂有毒的農用化學品中,新煙堿類殺蟲劑是世界范圍內發展最快的殺蟲劑之一。研究表明,新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂和其它傳粉者有一系列的負面影響,包括對工蜂的行為、學習、記憶、免疫能力、定向和覓食等方面的影響,還會降低了蜂王的生殖力。烯啶蟲胺是應用最廣泛的第二代新煙堿類殺蟲劑之一,與其他新煙堿類物質一樣,烯啶蟲胺也是昆蟲煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)的激動劑,在昆蟲中樞神經系統(CNS)的快速興奮性突觸傳遞中起重要作用。然而,由于其廣泛的用途和高水溶性的性質,它可以很容易地轉移到環境中。先前的一項研究證明,在加拿大薩斯喀徹溫省薩斯卡通市30公里范圍內的蜂箱中發現的花粉中含有烯啶蟲胺。同樣,最近的一項研究報告稱,在從中國不同地區采集的30份蜂蜜樣品中檢測到烯啶蟲胺殘留,其殘留量為13-41微克/千克。此外,據報道,烯啶蟲胺對非靶標生物有不良影響,研究發現烯啶蟲胺對6種非靶標生物有急性毒性,發現烯啶蟲胺對蚯蚓有中等毒性,對蜜蜂和家蠶有高毒性,因此應重視烯啶蟲胺對環境生物的潛在危害及其毒性效應。

腸道微生物在維持宿主健康方面發揮著重要作用。在蜜蜂體內,腸道微生物群相對簡單和保守,具有食品加工、免疫系統調節和病原體防御等功能。因此,研究農藥對腸道菌群的影響,將有助于探索農藥的作用機理,有利于農藥的使用和蜜蜂的保護。目前,新煙堿類殺蟲劑暴露對蜜蜂腸道菌群的負面影響的研究有限,只有最近的一項研究發現吡蟲啉降低了蜜蜂的存活率,但對腸道菌群沒有影響。因此,有必要對新煙堿類殺蟲劑進行環境毒理學研究,以反映其對蜜蜂腸道微生物的環境風險。在本研究中,蜜蜂暴露在一系列濃度的烯啶蟲胺中14天,以評估存活率、食物消耗量和腸道細菌群落,以及探索對蜜蜂腸道基因譜的影響??偟膩碚f,結果表明,暴露于烯啶蟲胺會擾亂蜜蜂的腸道微生物群,進一步影響代謝穩態和免疫,相信該結果可為新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的毒理學研究提供一些新的信息。

研究方法:

實驗設計:

蜜蜂連續喂飼含有3, 30, 300μg/L烯啶蟲胺濃度的50%(W/V)蔗糖溶液14天,50%蔗糖溶液作為對照(0微克/升)。每種處理組都有三個重復,每個重復包括30只工蜂。每24小時更新處理液,記錄各組死蜂,計算存活率。每天在將注射器中的溶液放入容器之前和從容器中取出之后對其進行稱重,這一差額相當于前一天活蜜蜂所消耗的食物總量,計算每只蜜蜂所消耗的食物量。殺蟲劑處理后,工蜂的中腸被收集在1.5毫升離心管中,立即冷凍在液氮中,保存在-80度低溫冰箱,直到進一步分析。

16S擴增子相對定量測序:

從每個組中,6條中腸匯集成1個生物樣本,每組包括3個生物學重復樣本(每組n=3),然后進行16S擴增子相對定量測序(V3-V4區域)。

RNA-seq測序:

從每個組中,6條中腸匯集成1個生物樣本,每組包括3個生物學重復樣本(每組n=3),然后進行RNA-seq測序。

研究結果:

烯啶蟲胺對蜜蜂的急慢性毒性

在急性毒性試驗中,蜜蜂在兩個時間點(24和48 hpf)的死亡率如圖1A所示。結果表明,烯啶蟲胺對蜜蜂的致死作用呈濃度依賴性。當烯啶蟲胺濃度為3.00 毫克/升及以下時,對照組與烯啶蟲胺組24小時死亡率無顯著性差異,而濃度為3.00 毫克/升以上時死亡率有顯著性差異,當暴露在6.00 毫克/升的烯啶蟲胺中,幾乎所有的蜜蜂都在48 hpf死亡(圖1A)。在慢性毒性試驗中,對照組蜜蜂存活率在90%以上,3微克/升和30微克/升濃度組的蜜蜂存活率與對照組無顯著差異(圖1B)。而300微克/升烯啶蟲胺處理組12天和14天的蜜蜂存活率顯著低于對照組,分別低至76.6%和73.3%(圖1B)。暴露于烯啶蟲胺14d后,對蜜蜂的累積攝食量也有明顯的影響,如圖1C所示,與對照組相比,在濃度為3和30微克/升烯啶蟲胺時,累積食物消耗量沒有顯著差異。(圖1C),而暴露于300微克/升烯啶蟲胺的蜜蜂的累積食物消耗量顯著低于對照組蜜蜂(圖1C)。

圖1   300μg/L烯啶蟲胺對蜜蜂的毒性效應。(A) 在24小時和48小時暴露于烯啶蟲胺后成年蜜蜂的急性死亡率。(B)不同濃度烯啶蟲胺對蜜蜂存活的影響。(C)不同濃度烯啶蟲胺對蜜蜂累積攝食量的影響。

烯啶蟲胺對蜜蜂腸道細菌群落的影響

為探討烯啶蟲胺對腸道菌群變化的影響,對對照組和暴露于300微克/升烯啶蟲胺14天的蜜蜂的腸道菌群進行了分析(n=3)。通過基于V3-V4區的16S擴增子測序,其中,對照組和300微克/升烯啶蟲胺組共同享有68個OTUs, 8個OTUs是在對照組特異存在,34個OTUs是在300微克/升烯啶蟲胺組特異存在。如圖2A所示,在門水平上,對照組和300微克/升烯啶蟲胺組中,Proteobacteria, Firmicutes 和Actinobacteria是最豐富的菌,兩組的微生物組成無顯著差異(圖2A)。在綱水平上,Gammaproteobacteria豐度顯著降低,從對照組的40.34%降低到300微克/升烯啶蟲胺組的11.09%(圖2B),烯啶蟲胺暴露后,Betaproteobacteria, Bacilli, Alphaproteobacteria的組成增加,Betaproteobacteria從26.10%增加到43.05%,Bacilli從27.10%增加到31.77%,Alphaproteobacteria從6.20%增加到13.17%(圖2B)。在屬水平, 300微克/升烯啶蟲胺組Frischella, Bartonella, Bifidobacterium的豐度均顯著增加,而Gilliamella的豐度顯著減少(圖2C)。

根據加權UniFrac的PCoA分析,300微克/升烯啶蟲胺組的腸道菌群與對照組有偏差(圖2D),但ADONIS分析得出PCoA的P值為0.20,表明兩組腸道菌群的差異不顯著。Top3菌屬的聚類分析結果顯示,烯啶蟲胺組腸道菌群與對照組相比差異顯著(圖2E)。此外,LEFSe分析表明,對照組中含有豐富的Gammaproteobacteria (class), Orbales (order), Orbaceae (family), Gilliamella (genera) and Gilliamella apicola (species),而在300微克/升烯啶蟲胺組中,Frischella (genera) , Frischella perrara, Lactobacillus helsingborgensis (species)含量豐富(圖2F)。


圖2 烯啶蟲胺對蜜蜂腸道菌群組成的影響。(A) 對照組和300mg/L烯啶蟲胺組腸道菌群的門水平組成。(B)對照組和300mg/L烯啶蟲胺組腸道菌群的綱水平組成。(C) 對照組和300mg/L烯啶蟲胺處理組在屬水平注釋到的序列百分比。(D) UniFrac主成分分析法(PCoA)分析對照組和300300mg/L烯啶蟲胺處理組的腸道微生物群。(E)對照組和300mg/L烯啶蟲胺處理組前30個最豐富屬的聚類熱圖。(F) LEFSe分析顯示不同組別樣品中細菌的差異。

原始序列處理與基因定量表達

為研究烯啶蟲胺對蜜蜂腸道基因表達的影響,采用RNA-seq技術分析了烯啶蟲胺(300μg/L)處理14d后與對照組(n=3)相比的蜜蜂腸道差異表達基因(DEGs)。每個文庫測到超過420萬個原始序列,超過92.83%的序列能成功地匹配到蜜蜂基因組的唯一或多個位置。如圖3A所示,烯啶蟲胺組和對照組表達的基因平均數分別為9481和9402;兩組中共表達9265個基因(圖3A)。暴露于300微克/升烯啶蟲胺的蜜蜂共檢測到526差異表達基因(DEGs),其中240(45.6%)被上調,54.4%被下調(圖3B)。根據表達模式的相似性,兩組之間所有顯著差異表達的基因(SDEGs)被繪制在熱圖中(圖3C),分層聚類將對照組蜜蜂的所有三個樣本聚集在一個集群內,而300微克/升烯啶蟲胺處理的蜜蜂形成另一個集群。使用其它聚類方法,如主成分分析(PCA),也得到了類似的結果(圖3D)。

除了未分類的基因外,我們還分析了表達上調最顯著的20個基因和表達下調最顯著的20個基因。這些差異基因編碼調節多種生物過程的蛋白質或酶。例如,在暴露于300微克/升烯啶蟲胺的蜜蜂腸道中,參與代謝的幾個基因發生了變化,如PEPCK(基因ID 412843)、FAXDC2(基因ID 727357)和載脂蛋白(基因ID 408961)等。此外,一些與免疫和病原體防御相關的基因也發生了顯著的改變,如Secapin(基因ID 406145)、TLR4(基因ID 724187)、endochitinase(基因ID 551600)等。此外,300微克/升烯啶蟲胺對蜜蜂腸道中幾種解毒相關基因的表達也有影響,如CYP6A14(基因ID 724946)、E4(基因ID 409801)和過氧化物酶(基因ID 100577249)。

圖3  烯啶蟲胺(300μg/L)處理14d后與對照組相比的蜜蜂腸道差異表達基因(DEGs)。(A)Venn圖表示烯啶蟲胺處理組和對照蜜蜂之間顯著差異表達基因(SDEGs)的數量。(B) 烯啶蟲胺(300μg/L)處理14d后的蜜蜂的差異表達基因的火山圖。紅點:烯啶蟲胺處理蜜蜂的上調基因;綠點:烯啶蟲胺處理蜜蜂的下調基因;藍點:無顯著差異。(C)兩組之間所有顯著差異表達的基因(SDEGs)的熱圖分析。(D) 烯啶蟲胺組與對照組差異表達基因的主成分分析(PCA)。

GO功能和KEGG通路分析

根據GO分析,462 個DEGs被分為三類:分子功能、細胞成分和生物過程,其中大多數差異基因歸類為分子功能,包括蛋白質異二聚活性、轉運體活性、蛋白質二聚活性、血紅素結合和四吡咯結合。在KEGG數據庫中,有84個DEGs被識別并映射到68個通路。表1列出了9條最重要的富集通路,包括戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、藥物代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、甘油磷脂代謝、淀粉和蔗糖代謝、鞘脂代謝、色氨酸代謝和卟啉、葉綠素代謝和視黃醇代謝(表1)。

表1  9條顯著富集通路。

Real-Time qPCR驗證

為了驗證RNA-Seq數據的結果,我們選擇了15個DEGs,其中7個來自最上調基因,8個來自最下調基因進行qPCR驗證,其中大多數基因參與免疫功能,如免疫、代謝、解毒和抗氧化反應,這些反應蜜蜂是響應環境壓力而激活的。如圖4A和4B所示,與對照組相比,烯啶蟲胺處理的蜜蜂的所有基因表達水平都有顯著差異(圖4A和4B),并且qPCR結果與測序結果一致。

圖4 實時定量PCR驗證RNA-Seq數據。(A)從最上調的基因中選擇7個用于qPCR驗證。(B) 從最下調的基因中選擇8個用于qPCR驗證



 

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